Questi batteri terricoli hanno la capacità unica di penetrare e fissare l’azoto atmosferico in associazione/simbiosi con le radici della pianta. Il meccanismo attraverso il quale si realizza la simbiosi è molto complesso, (lo vedremo più avanti) ma oramai abbastanza ben compreso.

I Rhizobium nel suolo sono batteri che presentano forme a bastoncino diritto, sono liberi di muoversi e si nutrono degli organismi in via di decomposizione. In questa situazione non sono in grado di fissare l’azoto. In situazioni particolari possono penetrare attraverso i peli radicali ed entrare nei tessuti della radice insediandosi nel citoplasma delle cellule dei noduli radicali prodotti dalla pianta e formando un nuovo “organo”. All’interno di queste cellule i Rhizobium subiscono mutamenti di forma e dimensione: si accrescono, diventando più grandi di quasi trenta volte, assumono forme ad Y oppure a bastoncino con ispessimento (clava), differenziano la struttura azoto-fissatrice, si avvalgono di una membrana plasmatica di origine vegetale e si trasformano in batteroidi iniziando il rapporto simbiotico che comporta un controllo da parte della pianta nella loro riproduzione.

Il processo di inoculazione e sviluppo simbiotico si può riassumere in quattro fasi principali :

1. riconoscimento pianta-batterio (Rhizobium)
2. diffusione dell’infezione batterica nelle radici
3. sviluppo del nodulo radicale e della struttura simbiotica
4. azoto fissazione e inizio del rapporto simbiotico

Prima fase – La pianta emette nel terreno flavonoidi che richiamano i batteri Rhizobium specifici per quel vegetale; i flavonoidi penetrano nelle cellule batteriche del Rhizobium e stimolano la produzione di una proteina chiamata NodD che attiva diversi geni di nodulazione che iniziano a sintetizzare un lipo-chito-oligosaccaride chiamato fattore Nod (o di nodulazione) (Werner, 2004). Il Nod viene emesso dal batterio e si comporta da ormone stimolando la risposta dell’apparato radicale della pianta.

Seconda fase – Il Nod emesso dal batterio e assorbito dalla pianta inizia a stimolare la divisione cellulare nelle radici e nei peli radicali che si accrescono. In particolare i peli radicali crescono asimmetricamente e tendono ad arrotolarsi a formare una sorta di canale attraverso cui il Rhizobium può penetrare nel tessuto radicale ed effettuare l’infezione. La progressione dei batteri nei canali d’infezione avviene per divisione cellulare: la pianta, infatti, fornisce ai batteri nutrimento e consente loro di riprodursi molto efficacemente e di spostarsi progressivamente verso il centro della radice dove formeranno il nodulo a partire da cellule meristematiche.

Terza fase – Raggiunta la concentrazione critica (15000-20000 batteri per ogni singola cellula vegetale infettata) è proprio la pianta che inibisce la formazione di nuovi noduli e la riproduzione batterica inducendo la fase di trasformazione somatica dei batteri in batteroidi e la formazione dei veri e propri noduli: essi si ricoprono di una membrana plasmatica vegetale, aumentano di volume (fino ad oltre 30 volte il volume iniziale), cambiano forma, si formano gli organi per l’azoto fissazione. Tutte queste trasformazioni, che portano alla formazione del nodulo, sono il risultato di una interazione tra le sostanze emesse dal batteroide e le risposte molecolari della pianta. Se queste sostanze non vengono riconosciute dall’ospite non si formano i noduli. La formazione dei noduli produce una inibizione dell’ormone Nod che rappresenta il regolatore della divisione cellulare del batteroide: diminuendo la concentrazione di Nod si inibisce la riproduzione del “Rhizobium”.

Quarta fase – I batteroidi iniziano a fissare l’azoto attraverso un complesso multi-enzimatico che consente alla nitrogenasi di catalizzare la formazione di un composto azotato di facile assimilazione per la pianta. La quantità di azoto fissato è legata direttamente alla pressione di ossigeno presente nel nodulo che è regolata dalla leghemoglobina, una proteina simile all’emoglobina. Inizia, quindi, il rapporto simbiotico mutualistico: entrambi concorrono per la formazione della leghemoglobina essenziale per la nitrogenasi, i batteroidi forniscono alla pianta azoto facilmente assimilabile (NH₃ e/o NH₄⁺), la pianta fornisce ai batteroidi carboidrati e proteine.

La fissazione dell’azoto atmosferico o azotofissazione consiste nella riduzione, tramite la nitrogenasi, dell’azoto molecolare (N₂) in azoto ammonico (NH₃). L’azoto ammonico è successivamente reso disponibile per molte importanti molecole biologiche quali gli amminoacidi, le proteine, le vitamine e gli acidi nucleici attraverso i processi di nitrificazione e nitratazione. L’azoto fissazione non avviene al di sotto di 9°C.

In condizioni di campo, i primi noduli si formano entro una-due settimane dopo l’emergenza delle piantine e diventano visibili in quanto aumentano di dimensione. L’azoto fissazione inizia tra la fase V1 (prima trifoliata)  e V3, dopo di che il numero di noduli e la quantità di azoto fissato continuano ad aumentare; durante la fase riproduttiva una singola pianta di soia può accumulare alcune centinaia di noduli radicali. La maggiore richiesta di azoto è tra gli stadi R5 a R8.

IMPORTANTE: Tra lo stadio V3 a V4, dovrebbero essere presenti da 8 a 14 noduli per pianta.

Quali sono i fattori che influenzano lo sviluppo dei noduli ?

• disponibilità di ossigeno nel suolo (i Rhizobium sono batteri che necessitano di ossigeno).
• un pH inferiore a 5.6 o superiore a 8.0 crea un contesto difficile per la funzionalità dei batteri.
• ritardi tra inoculazione e semina. I batteri muoiono rapidamente quando esposti a temperature estreme e a condizioni di essiccazione.(Occorrerebbe inoculare una quantità di seme che può essere piantata entro sei ore).
• improprie condizioni di conservazione dell’inoculante. Gli inoculanti devono sempre essere tenuti al fresco e lontano dalla luce solare diretta.
• lo stress delle piante può provocare ritardi nella la formazione dei noduli, arrivando anche a far arrestare il processo di azotofissazione.
• bassi livelli di fosfato disponibile possono rallentare lo sviluppo piantina e ridurre la capacità della pianta di fissare l’azoto.
• un terreno asciutto durante le prime due settimane dopo la semina può portare ad essiccazione dell’inoculante e morte del Rhizobium.
• alti livelli di azoto del suolo (più di 55 kg/ha) possono interferire con la formazione dei noduli.

• se nella sezione il nodulo presenta aree o macchie di colore rosato (indice della presenza del complesso leghemoglobina) allora iviavviene la fissazione dell’azoto;
• se nella sezione il nodulo appare completamente bianco o verde significa che in quel sito non avviene la fissazione ma che comunque sono presenti i batteroidi: probabilmente una errata comunicazione molecolare-biologica tra batteroide e pianta ha di fatto bloccato il rapporto di simbiosi mutualistica;
• se nella sezione il nodulo appare di colore grigio o marrone significa che in quel nodulo non solo non avviene la fissazione dell’azoto ma che anche i batteroidi sono morti e che è in corso un processo di degradazione.

• http://www.agriculture.gov.sk.ca/inoculation_pulse_crops
• Agronomy: Thinking about Nitrogen Fixation | ILSoyAdvisor.com
• Biogeochemistry DOI 10.1007/s10533-014-0061-4
• wikipedia portale microbiologia
• Department of Agronomy, Iowa State University, Ames, IA (varie web)
• www.microbiologyonline.org.uk
• http://overton.tamu.edu/facultystaff/geraldwayneevers/coolseasonlegumes/nitrogenfixation/#.VUPHC_ntmko
• Nitrogen Fixation by Legumes Guide A129 W.C. Lindemann, Soil Microbiologist C. R. Glover, Extension Agronomist BIOLOGICAL NITROGEN FIXATION
• University of Nebraska – Lincoln 4-29-2008 Nitrogen uptake, fixation and response to fertilizer N in soybeans: A review